正常皮膚メラノサイト

1.ご案内
真皮線維芽細胞 皮膚メラノサイトは表皮の最下層に存在し、 紫外線を吸収して皮膚を守るメラニン色素を産生します。本細胞は、 皮膚表皮組織より調製した正常メラノサイトであり、凍結状態で分譲しています。 細胞の性状としてドーパ反応によるチロシナーゼ活性の存在、 及びメラノサイト特異的細胞マーカーを確認しています(図2、図3参照)。 メラニン産生に関する研究、紫外線による炎症研究、化粧品の開発研究等に有用な研究資源です。

2.分譲可能なメラノサイト(凍結)
資源番号 提供者 細胞数/本 解凍直後の生存率(*1) 本数
HT47250950-M 女性(幼児) 7.6 x 105 90% 18本
HT1700-M(*2) 男性(幼児) 8.5 x 105 96% 21本
HT2356-M 女性(幼児) 8.3 x 105 61% 26本

(*1)バイアルを微温湯で解凍した直後にトリパンブルー染色し、計数した細胞数から求めた数値です。 解凍翌日の生存率・接着率はこの数値より低下いたします。メラノサイトは凍結融解に弱いため、 解凍翌日にはかなり多数の細胞が死滅します。
現在のロットの推奨培地は、MGM-4 + 0.1μM endothelin-3(Lonza)です。

(*2)TYRP-1免疫抗体染色の結果は陽性を示しますが、DOPA反応が認められる細胞の割合は極めて少なく、細胞ペレットは白色を示します。

3.由来組織
  • 日本人
  • 多指症の形成外科手術で摘出された余剰皮膚組織
  • HCV、梅毒の検査結果は陰性
  • 遺伝子解析研究への利用は不可
4.細胞の調製
皮膚組織

細胞分離処理(dispase II処理、表皮・真皮分離)

表皮

細胞分散(0.25% トリプシン / 0.02% EDTA 処理)

表皮角化細胞と共にフラスコへの細胞播種

初回継代時0.25% トリプシン / 0.02% EDTAによる差時剥離法によりメラノサイトを分離

MGM-4 + endothelin-3にて培養。0.25% トリプシン / 0.02% EDTAで継代、Geneticin処理による線維芽細胞除去

セルバンカー 1に懸濁

プログラミングフリーザーにて緩慢凍結

液体窒素タンクに保管

5.細胞の性状検査
  • 使用機材
    • 培養培地:MGM-4 BulletKit(Lonza, Code No.: CC-3249)
    • 培養器質:付着細胞培養用プラスチックディッシュ/フラスコ/マルチウェルプレート、またはtype I collagenコートチャンバースライド(IWAKI Code No.: 4722-010; 免疫染色時)
    • DOPA試薬: 0.1% 3-(3,4-dihydroxyphenyl)-L-alanine(和光純薬 Code No.: 047-30541) in PBS(-)
    • 免疫染色抗体:TYRP1 マウス・モノクローナル抗体(Novus Biological社 Code No.:NBP2-32906, clone TA99; 1/200希釈)
  • 解凍直後の全細胞数、生細胞数: トリパンブルー色素排除法
  • 増殖確認(図1)
  • DOPA反応陽性の確認(図2)
  • 細胞マーカー(Tyrosinase-related protein 1(TYRP1, 別名Mel5)の発現確認(図3)
  • 微生物汚染検査(細菌・真菌・マイコプラズマ): 陰性を確認
【図1】解凍後の細胞増殖
培養1日後
培養5日後

【図2】DOPA反応

【図3】TYRP1免疫抗体染色